免疫熒光Immunofluorescence
免疫熒光染色技術(shù)是將熒光素作為抗體標(biāo)記物進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，帶有熒光素的抗體孵育后可以直接使用熒光顯微鏡觀測(cè)。該技術(shù)的主要特點(diǎn)是：特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快；缺點(diǎn)是由于熒光素有一定的淬滅周期，玻片無(wú)法長(zhǎng)期保存，需要在染色結(jié)束后盡快進(jìn)行鏡下觀測(cè)分析。
免疫熒光染色分為直接法和間接法。直接法是熒光素直接標(biāo)記在一抗上，孵育后直接觀測(cè)，快速高效，還可以與多個(gè)標(biāo)記抗體一起做多重?zé)晒馊旧?。間接法是熒光素標(biāo)記在二抗上，相比直接法染色背景更干凈，費(fèi)用花費(fèi)也少。
免疫熒光染色與免疫組化前期處理相同，因?yàn)閮?nèi)源性過(guò)氧化物酶對(duì)免疫熒光實(shí)驗(yàn)沒(méi)有影響，同時(shí)雙氧水反而會(huì)干擾到熒光素發(fā)光，所以這步操作在免疫熒光中不需要做。
常用的熒光顯微鏡一般有三個(gè)通路，激發(fā)波長(zhǎng)為350nm、488nm、555nm附近，分別對(duì)應(yīng)的熒光發(fā)射光顏色為藍(lán)光、綠光、紅光。
350nm常用熒光素：DAPI（復(fù)染用），Alexa Fluor 350
488nm常用熒光素：FITC，Alexa Fluor 488
555nm常用熒光素：PE、Cy3、Rhodamine B、Alexa Fluor555
另有其他常見(jiàn)熒光素
594nm常用熒光素：Texas Red、Alexa Fluor594
647nm常用熒光素：Cy5、APC、Alexa Fluor647
免疫熒光雙重染色熒光雙染或多重染色是指將帶有不同熒光素標(biāo)記的抗體孵育在同一張切片上，鏡下觀察時(shí)將不同的顏色組合在一起，將不同的抗原表達(dá)情況一起呈現(xiàn)出來(lái)，這樣分析多個(gè)抗原的關(guān)聯(lián)性更客觀、更直接。
熒光雙染也有直接法和間接法。直接法是使用帶有不同熒光素標(biāo)記的兩個(gè)抗體同時(shí)孵育后觀測(cè)；間接法需要用到兩個(gè)不同種屬來(lái)源的一抗（例如一個(gè)鼠源抗體，一個(gè)兔源抗體），后面要選擇與一抗相對(duì)應(yīng)的二抗同時(shí)需要帶有不同的熒光素標(biāo)記（例如FITC標(biāo)記山羊抗小鼠和Cy3標(biāo)記山羊抗兔），間接法需要同時(shí)兼顧一抗和二抗的種屬關(guān)系，避免出現(xiàn)相互的交叉反應(yīng)。
北京博奧森生物石蠟切片的免疫熒光單染（間接法）
1.石蠟切片正常脫蠟至水，PBS洗5分鐘，2次
2.抗原修復(fù)，0.01M枸櫞酸修復(fù)液，沸水浴熱修復(fù)15分鐘
3.正常山羊血清封閉20分鐘，37℃
4.一抗孵育，4℃過(guò)夜。
5.PBS洗5分鐘，3次
6.熒光標(biāo)記二抗孵育，37℃，90分鐘
7.PBS洗5分鐘，3次
8.DAPI復(fù)染，PBS洗5分鐘，3次
9.防淬滅熒光封片劑封片
10.鏡檢
