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研究背景

器官移植是21世紀(jì)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最輝煌的成就之一，已有數(shù)十萬器官終末期患者因此而得到救治，不僅延長(zhǎng)了器官衰竭和病變患者的壽命，還提高了他們的生命質(zhì)量。

糖尿病是嚴(yán)重危害人類健康和生命的常見慢性代謝性疾病。近年來胰島移植治療糖尿病取得了突破性進(jìn)展，是治療胰島素依賴型糖尿病的有效方法；然而供體的嚴(yán)重匱乏和移植排斥反應(yīng)制約了臨床胰島移植的廣泛應(yīng)用。而干細(xì)胞可以在體外自我增殖且具有分化成為各種組織細(xì)胞的潛能，因此若將干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成為胰島細(xì)胞有望成為解決胰腺供體缺乏的有效途徑。

已有研究結(jié)果證實(shí)大鼠胰腺可以從小鼠體內(nèi)通過大鼠多能干細(xì)胞與小鼠囊胚的異種重構(gòu)獲得。雖然通過這種方法可以獲得大鼠來源且有功能的胰腺，但是這些胰腺都是小鼠胰腺大小，提取不出足夠的胰島用于治療糖尿病模型的實(shí)驗(yàn)大鼠。

研究結(jié)果

東京大學(xué)干細(xì)胞生物學(xué)和再生醫(yī)學(xué)研究中心Tomoyuki Yamaguchi等通過反向設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)（Fig.1），將小鼠多能干細(xì)胞（PSCs）注射到 Pdx1缺乏的大鼠囊胚內(nèi)，獲得了大鼠胰腺大小且來源于小鼠多能干細(xì)胞的胰腺。然后將提取出的胰島移植到鏈唑霉素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型中。在無免疫抑制劑的情況下，移植后的胰島可以穩(wěn)定調(diào)控宿主小鼠機(jī)體血糖水平，從而有力地證明了通過多能干細(xì)胞異種囊胚重構(gòu)獲得胰島的治療潛力，為最終開展臨床胰島移植奠定了臨床前基礎(chǔ)。

Fig.1 Schema of concept for treatment of diabetes by interspecies blastocyst complementation

研究解析

1.生成Pdx1 缺乏的大鼠

Pdx1是大鼠和小鼠高度保守的編碼基因，有相同的同源結(jié)構(gòu)域，是胰腺干細(xì)胞發(fā)育過程中表達(dá)的第一個(gè)分子標(biāo)志，其純合子缺失突變會(huì)導(dǎo)致胰腺無法形成。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，利用TALEN基因編輯技術(shù)，通過雜交獲得突變的純合子Pdx1mu/mu大鼠(Fig.2) 。

Fig.2 Generation of apancreatic rats by TALEN-mediated

2.嵌合型胰腺的生成

為了獲得種間嵌合體，經(jīng)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）標(biāo)記的小鼠多能干細(xì)胞，被注入Pdx1^+/mu大鼠囊胚中，雜交獲得突變的純合子Pdx1^mu/mu大鼠，相較于Pdx1^+/mu大鼠，EGFP的表達(dá)在Pdx1^mu/mu大鼠胰腺中已完全覆蓋，胰腺大小與同時(shí)期野生型大鼠胰腺相當(dāng)，且胰腺組織的內(nèi)分泌表達(dá)激素(如胰島素、胰高血糖素、生長(zhǎng)抑素等)與野生型大鼠胰腺的表達(dá)也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Fig.3a-b）。

進(jìn)一步檢測(cè)mouseR胰腺功能，GTTs結(jié)果顯示Pdx1^mu/mu大鼠宿主胰腺對(duì)葡萄糖的應(yīng)激反應(yīng)略為緩慢，60min后血糖水平出現(xiàn)下降趨勢(shì)，約2小時(shí)恢復(fù)到正常水平；但GTT AUC沒有明顯的差異（Fig.3c-d）。由此可知，嵌合型胰腺可以在宿主體內(nèi)發(fā)揮正常的血糖調(diào)節(jié)功能。

Fig.3 Generation of mouse pancreata in rat by interspecies blastocyst complementation

3.移植嵌合型胰島到糖尿病模型小鼠體內(nèi)

為了檢測(cè)嵌合型胰島的治療潛能，將分離后的胰島移植于鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)建立的C57BL/6N糖尿病模型小鼠腎被膜下。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)移植后的嵌合型胰島呈現(xiàn)正常胰島樣形態(tài)，且同樣可表達(dá)EGFP(Fig.4a)。移植后的胰島可以在沒有免疫抑制的情況下穩(wěn)定調(diào)控宿主血糖370多天，且在GTTs實(shí)驗(yàn)中調(diào)控反應(yīng)表現(xiàn)正常。但當(dāng)實(shí)驗(yàn)小鼠實(shí)施腎切除手術(shù)（包含移植后的胰島）后，其血糖含量立即升高(Fig.4b)，由此充分證明移植后的胰島在宿主體內(nèi)可以行使調(diào)控機(jī)體血糖的功能。移植后宿主機(jī)體并未出現(xiàn)明顯的免疫反應(yīng)，T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分別分泌表達(dá)的CD3和CD11b未顯著表達(dá)(Fig.4c)。

Fig.4 Transplantation of mouse R islets into mice with drug-induced diabetes

為了使這種方法真正運(yùn)用于臨床，可以將人類干細(xì)胞整合到更大的動(dòng)物胚胎中，使其產(chǎn)生適合人類大小的胰島。豬和人的胰島結(jié)構(gòu)較為接近，且豬胰島素已成功應(yīng)用于臨床，故豬成為臨床異種胰島移植最有希望的動(dòng)物供體之一。但如何獲取大量高質(zhì)量的功能性胰島細(xì)胞及有效抑制異種免疫排斥反應(yīng)仍是異種胰島移植的主要問題。

文獻(xiàn)來源：[IF:41.58]Tomoyuki Yamaguchi.et al. Interspecies organogenesis generates autologous functional islets. Nature. 2017 02 09;542(7640)

本文研究使用及相關(guān)的Bioss抗體