同型對照是什么？
同型對照 (Isotype control) 是一種與一抗保持相似特性但缺乏特異性靶標(biāo)的抗體。在流式實(shí)驗(yàn)中，同型對照作為陰性對照，可以區(qū)分特定抗體信號與非特異性背景染色，能夠排除干擾因素以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。同型對照還可以用于設(shè)定流式細(xì)胞儀的電壓，并有效節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本。
產(chǎn)生背景染色的原因？
1.抗體與靶細(xì)胞的 Fc 受體、內(nèi)源性酶、死細(xì)胞等因素的非特異性結(jié)合產(chǎn)生的背景染色。
2.細(xì)胞本身的熒光產(chǎn)生的背景染色。
3.流式儀器產(chǎn)生的背景染色。
圖1. HepG2 和 A549 細(xì)胞通過使用抗體 Caspase-3 (bs-0081R-FITC) 進(jìn)行流式細(xì)胞檢測，藍(lán)色為空白對照，黃色為同型對照，綠色為特異性一抗。流式實(shí)驗(yàn)中根據(jù)同型對照設(shè)置陰性閾值。
什么情況下應(yīng)使用同型對照？
同型對照也不是適用于所有情況。同型對照僅能檢測不由表位引起的非特異性結(jié)合，而相似表位不同抗原，或不同表位相同抗原產(chǎn)生的交叉反應(yīng)就不能被同型對照檢測。在以下情況中，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)使用同型對照以確保流式實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性：
1.實(shí)驗(yàn)人員流式實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)較少時(shí)應(yīng)使用同型對照;2.進(jìn)行胞內(nèi)流式實(shí)驗(yàn)，包括胞內(nèi)因子，趨化因子，蛋白信號等應(yīng)使用同型對照;3.使用不常見或特異性不高的抗體時(shí)應(yīng)使用同型對照。
如何選擇同型對照？
在實(shí)驗(yàn)中選擇的同型對照需要與一抗的特性相匹配。合適的同種型對照應(yīng)與一抗的宿主種族、Ig亞型、偶聯(lián)物、輕鏈和工作濃度相同。在流式實(shí)驗(yàn)中，選擇合適的同型對照可以有效排除干擾因素，實(shí)現(xiàn)更精確的數(shù)據(jù)分析。而選用 PBS 作為空白對照則達(dá)不到同樣的效果，甚至可能誤導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果。
流式檢測中的常用同型對照
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抗體名稱 |
標(biāo)記熒光素 |
貨號 |
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Mouse IgG1 |
FITC |
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PE |
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PerCP |
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Mouse IgG2a |
FITC |
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PE |
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PerCP |
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Mouse IgG2b |
FITC |
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PE |
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PerCP |
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Mouse IgG |
FITC |
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PE |
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APC |
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AF488 |
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AF594 |
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AF647 |
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CY3 |
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CY5 |
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Rat IgG |
FITC |
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PE |
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APC |
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AF488 |
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AF594 |
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AF647 |
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CY3 |
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CY5 |
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Rat IgG |
FITC |
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PE |
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APC |
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AF488 |
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AF594 |
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AF647 |
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CY3 |
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CY5 |
