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新品上市丨還在反復(fù)摸索抗體稀釋比列? 這篇IHC秘籍快來(lái)收好!
發(fā)表者:北京博奧森生物      發(fā)表時(shí)間:2023-8-14



      免疫組化技術(shù)由于具有特異性強(qiáng)、敏感性高、定位準(zhǔn)確的特點(diǎn),對(duì)于疾病的診斷與鑒別診斷有著重要意義,當(dāng)免疫組化結(jié)果沒(méi)有出現(xiàn)預(yù)期的效果時(shí),應(yīng)系統(tǒng)的分析和查找原因,找到有效的解決辦法。

      IHC實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣,包括切片制作(固定,脫水,透明,包埋,切片,貼片,烤片),脫蠟,水化,阻斷,抗原修復(fù),封閉,一抗孵育,二抗孵育,顯色,復(fù)染,封片和分析等,在上次的推文中向您介紹了切片制作和抗原修復(fù)兩個(gè)步驟中的常見(jiàn)問(wèn)題及解析,本次為您帶來(lái)的是封閉和一抗孵育中的注意事項(xiàng)。文末還附有IHC通關(guān)的秘密武器——Bioss全新上市的IHC即用型試劑盒,助您一次獲得文獻(xiàn)級(jí)的圖像結(jié)果。


封閉

1.圖片背景值過(guò)高。

解決方法:①在使用抗體前采用溶于甲醇或水的3% H2O2或使用專(zhuān)門(mén)的試劑盒進(jìn)行淬滅,并使用堿性磷酸酶抑制劑,以減少內(nèi)源性過(guò)氧化物酶或磷酸酶的干擾;

②使用生物素類(lèi)的二抗系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)如腎臟和肝臟等富含生物素的組織樣本時(shí),可以在一抗孵育前用親和素/生物素封閉試劑進(jìn)行封閉,以減少內(nèi)源性生物素活性的干擾;

③在加入抗體前把多余的緩沖液吸干,而非對(duì)組織樣品進(jìn)行洗滌,以減少來(lái)自內(nèi)源性酶的干擾;

④蛋白封閉時(shí)間不足導(dǎo)致背景增強(qiáng)甚至出現(xiàn)假陽(yáng)性,應(yīng)選擇合適的封閉液,適當(dāng)延長(zhǎng)封閉時(shí)間;

⑤所用血清溶血,應(yīng)選擇合適的封閉液。

2.染色結(jié)果呈假陰性。解決方法:①封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致陽(yáng)性信號(hào)減弱甚至出現(xiàn)假陰性,應(yīng)選擇合適的封閉液,適當(dāng)減少封閉時(shí)間;②血清封閉液和一抗來(lái)源種屬相同,血清中的抗體可能和目的蛋白特異性結(jié)合了,進(jìn)而導(dǎo)致一抗沒(méi)有結(jié)合位點(diǎn),產(chǎn)生假陰性。

3.目標(biāo)蛋白定位異常。解決方法:①熱滅活正常血清或BSA對(duì)組織進(jìn)行封閉孵育。


一抗孵育

1.圖片背景值過(guò)高。

解決方法:①抗體孵育后洗滌不充分,殘留抗體導(dǎo)致背景染色,建議增加抗體孵育后的浸洗次數(shù),延長(zhǎng)浸洗時(shí)間。

2.染色結(jié)果過(guò)強(qiáng)。解決方法:①一抗?jié)舛冗^(guò)高是常見(jiàn)原因之一,可適當(dāng)調(diào)整抗體稀釋比;②一抗孵育溫度高,時(shí)間長(zhǎng),一般建議4℃過(guò)夜孵育,低溫雖然會(huì)使抗體結(jié)合緩慢,但特異性結(jié)合更好。

3.陽(yáng)性檢測(cè)率及著色強(qiáng)度相對(duì)減弱,甚至無(wú)染色。解決方法:①抗體效價(jià)不高??赏ㄟ^(guò)增加抗體使用濃度,延長(zhǎng)抗體孵育時(shí)間進(jìn)行調(diào)整;②所用抗體不適用于IHC實(shí)驗(yàn)。建議在非變性WB上測(cè)試該抗體,以確??贵w識(shí)別非變性抗原,或是選用通過(guò)IHC實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的抗體;③一抗二抗不匹配。使用針對(duì)一抗物種來(lái)源的二抗,如一抗宿主為rabbit,則須使用anti-rabbit的二抗;④抗體失活。避免將標(biāo)記熒光基團(tuán)的二抗放置于光照環(huán)境;⑤靶蛋白為核蛋白而抗體不能穿透細(xì)胞核時(shí),建議在封閉溶液與抗體稀釋液中加入合適的滲透試劑,例如Triton X-100,以促進(jìn)抗體滲透到細(xì)胞內(nèi)。

4.染色結(jié)果呈弱陽(yáng)性。解決方法:①適當(dāng)調(diào)整抗體稀釋比,或者選擇染色強(qiáng)度高,高親和力的抗體;②設(shè)置陽(yáng)性組織切片的對(duì)照,因?yàn)橥坏鞍自诓煌M織中的表達(dá)會(huì)有很大的差異;③切片在染色過(guò)程中抗體過(guò)濃或干燥了。切片上遺留了過(guò)多的沖洗液,當(dāng)抗體加至切片上時(shí);等于人為地對(duì)抗體進(jìn)行了進(jìn)一步的稀釋?zhuān)渭釉噭┣皯?yīng)盡量減少殘余液體。

5.染色結(jié)果出現(xiàn)非特異性染色。解決方法:①可以通過(guò)調(diào)整抗體的稀釋比進(jìn)行改善,特異性強(qiáng)的抗體則不易受稀釋比的影響;②一抗?jié)舛忍?,在使用新抗體前可以通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索出最理想的工作濃度,不能簡(jiǎn)單地按照說(shuō)明書(shū)來(lái)用;③孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或孵育溫度過(guò)高,建議摸索不同抗體的最佳孵育條件;④一抗非特異性結(jié)合過(guò)高,可通過(guò)降低一抗?jié)舛然蚩s短孵育時(shí)間進(jìn)行改善;⑤一抗與實(shí)驗(yàn)組織同源,加入二抗后,二抗與組織結(jié)合。應(yīng)換與組織非同源的一抗;⑥一抗為多抗,建議更換為單克隆抗體;⑦抗體稀釋液中添加非離子型去污劑包括Triton X-100或Tween 20減少非特異性疏水相互作用。


新品上市

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      受篇幅限制,本次IHC實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的常見(jiàn)問(wèn)題解析就先分享到這里。如果您還想更深入的學(xué)習(xí)IHC相關(guān)問(wèn)題,可以繼續(xù)關(guān)注本系列后續(xù)文章。如果您在使用我們的產(chǎn)品時(shí)出現(xiàn)任何問(wèn)題,請(qǐng)隨時(shí)聯(lián)系我們,Bioss資深I(lǐng)HC實(shí)驗(yàn)專(zhuān)家將為您全面講解,深度分析,幫助您輕松解決IHC的“疑難雜癥”!


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